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O gene FLR1 (sem o seu codão STOP) é amplificado por PCR com iniciadores híbridos (G5/F5 e G3/F3) desenhados de forma a acrescentarem de cada lado do gene duas zonas de homologia com o vector pMET25_GFP e com base na sequência depositada na base de dados SGD, (ver como).
Paralelamente, o vector pMET25_GFP é linearizado pela enzima de restrição NotI, na região entre o promotor MET25 e o gene que codifica a GFP. A transformação de células de levedura (procedimento experimental) com os dois fragmentos de DNA (o gene FLR1 amplificado por PCR e vector linearizado) conduz à recombinação homóloga entre as duas zonas de homologia e à re-circularização do vector obtendo-se a fusão do gene FLR1 com o gene da GFP, in vivo, como esquematizado na Figura 1.
Fig. 1 - Esquema representativo da estratégia seguida para a obtenção in vivo da fusão genética FLR1::GFP. Para a construção da fusão em causa recorreu-se ao plasmídeo pMET25_GFP, contendo o promotor forte MET25 seguido do gene GFP ( A), que se linearizou por restrição com a enzima NotI ( B). Paralelamente, o gene alvo de estudo ( C) foi amplificado por PCR por forma a ter duas zonas de homologia, com o promotor MET25 e com o gene GFP ( D). A transformação de Saccharomyces cerevisiae com o plasmídeo pMET-GFP, linearizado e desfosforilado, e com o gene FLR1 permite a obtenção, por recombinação in vivo entre as duas zonas de homologia ( E), da construção de interesse em levedura ( F).
Os plasmídeos obtidos são posteriormente confirmados por análise do seu mapa de restrição (saber como). A construção genética, após confirmação, é então expressa nas células de levedura e a localização subcelular da proteína de fusão é observada por microscopia de fluorescência.
A fusão anterior permitiu localizar a proteína Flr1 na periferia celular o que aponta para uma localização da proteína Flr1 na membrana plasmática das células de levedura, como descrito em “Localização subcelular da proteína Flr1”.
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