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Presentemente a técnica de amplificação de DNA por PCR está na base da maioria das técnicas de biologia molecular e genética. Esta reacção de amplificação pressupõe a existência de:
- uma cadeia de DNA molde, a partir da qual são amplificadas as novas cadeias de DNA que, no presente exemplo, é DNA genómico de levedura (procedimento experimental)
- um par de iniciadores (ou primers) que vai hibridar com a cadeia de DNA molde, no início (iniciador 5’ ou forward) e no fim (iniciador 3’ ou reverse) do fragmento de DNA a amplificar (Fig. 1).
No entanto, em muitos casos, os iniciadores de PCR são desenhados pelo investigador, de forma a introduzirem regiões de DNA específico, que podem ir até 60 pb, antes e depois do fragmento de DNA a amplificar. Estes iniciadores de PCR, denominados por iniciadores híbridos, podem inclusivamente servir para acrescentar a cada lado do fragmento de DNA, sequências de corte para enzimas de restrição específicas (Fig. 1). Este procedimento facilita a clonagem do fragmento de PCR num vector de clonagem, devendo as enzimas de restrição ser escolhidas caso a caso, de acordo com o perfil de restrição do vector e do fragmento de DNA a clonar, pois estas não devem cortar dentro de nenhum dos dois.
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| Fig. 1 -Reacção de PCR em que se usaram iniciadores de PCR híbridos, que acrescentaram de cada lado do fragmento amplificado duas sequências de DNA novas. |
Figura animada sobre a reacção de PCR: http://allserv.rug.ac.be/~avierstr/principles/pcrani.html
De seguida, são apresentados exemplos de como se procedeu à selecção e desenho de iniciadores de PCR, para responder a questões experimentais concretas. O recurso a primers hibridos foi efectuado na construção da cassete de eliminação do gene FLR1 (saber mais) e na construção das fusões GFP::FLR1 (saber mais) e FLR1::lacZ (saber mais).
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