Transformação de células de levedura

Esta técnica pode ser usada para introduzir em células de levedura DNA plasmídico ou DNA recombinante (como por exemplo cassetes de eliminação de genes de levedura).

No primeiro dia, de manhã, prepara-se uma pré-cultura em 50 ml de meio líquido YPD (2% extracto de levedura; 1% peptona). No mesmo dia, ao fim da tarde dilui-se a referida pré-cultura, para o volume necessário (10 ml para cada transformação a realizar), de forma a ter no dia seguinte, de manhã, uma DO_600nm de cerca de 0,5-0,7 (considera-se que a cultura leva 90 min a duplicar). No segundo dia, e para uma cultura de 100 ml, centrifugam-se as células 5 min a 4000 rpm, lavam-se em 30 ml de água estéril. Ressuspendem-se as células em 1 ml de água estéril e transferem-se para 2 microtubos de 2 ml. Centrifugam-se 30 segundos e elimina-se a água. Lava-se cada sedimento celular em 0,5 ml de AcLi/TE, centrifuga-se e ressuspendem-se ambos os sedimentos celulares em 0,5 ml de AcLi/TE. A 50 ml de suspensão celular adicionaram-se 5 ml de DNA de esperma de salmão sonicado (10 mg/ml), 1 mg de DNA a transformar e 300 ml de solução PEG/AcLi/TE e homogeniza-se delicadamente. Incuba-se esta mistura a 30°C, durante 30 min com agitação seguido de 42°C durante 20 min. Por fim, lavam-se as células em 1 ml de H₂O. Aquando das transformações com plasmídeos ressuspendem-se as células em 500 ml de água estéril, espalham-se 100 ml numa placa de Petri e o restante noutra placa de Petri de meio MM2-U. Aquando das transformações com cassetes de eliminação, ressuspendem-se as células em 1 ml de YPD, incubam-se 4 horas a 30°C, centrifugam-se e espalham-se numa placa de Petri YPD contendo 200 mg/ml de geneticina G418 (a marca de selecção desta).

Soluções: 10Í AcLi: 1m AcLi pH 7.5 (ajustado com ácido acético); 10Í TE: 0.1 M TRIS pH 7.5; 0.01 M EDTA pH 7.5; PEG 4000 50%; AcLi/TE: 1/10 vol 10X AcLi + 1/10 10Í TE; PEG 40%/AcLi/TE: 8/10 vol PEG 4000 50% + 1/10 vol 10Í AcLi + 1/10 10Í TE