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Uma informação muito importante para a análise funcional dos transportadores MFS-MDR é a sua localização subcelular. Uma das técnicas mais usadas para este fim é a expressão, na célula, de uma proteína de fusão com proteína verde fluorescente GFP (Green Fluorescent Protein) proveniente da medusa Aequorea victoria. A expressão da referida fusão genética, numa célula de interesse, pode ser observada por microscopia de fluorescência e assim determinar a sua localização subcelular.
A técnica de fusão usada para a localização é mais um exemplo das possibilidades que são oferecidas pelas abordagens pós-genómicas, visto que requer apenas o conhecimento da sequência de nucleótidos da região codificante do gene cuja localização se pretende fazer. Assim, é possível aplicar esta técnica a proteínas cuja função biológica não está ainda perfeitamente estabelecida.
A construção da fusão genética FLR1::GFP, de que aqui se dá exemplo, é feita com base num vector de clonagem (neste caso o vector pMET25_GFP; Boles E., resultados não publicados) onde está já inserida o gene codificante para a GFP. O gene FLR1, a que foi retirado o codão STOP, foi amplificado por PCR e clonado em fase em o gene GFP como esquematizado na Figura 1 (ver como).
Um dos problemas limitativos desta técnica pode ser ao nível da detecção do sinal fluorescente da GFP. Para o ultrapassar, e para a proteína de fusão ter níveis de expressão apreciáveis, a fusão genética está sob a acção de um promotor forte, neste caso o promotor do gene de levedura MET25 (Mumberg et al., 1994).
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| Fig. 1 - Esquema representativo do plasmídeo, contendo a fusão genética FLR1::GFP, construído para proceder à localização subcelular in vivo da proteína Flr1 em células de S. cerevisiae.
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| Fig. 2 - Localização subcelular da proteína Flr1p ao nível da membrana plasmática de S. cerevisiae detectada com recurso à expressão de uma fusão genética FLR1-GFP (B). Em (A) as células albergam um plasmídeo controlo (sem fusão) pelo que apenas se detecta a fluorescência basal das células. |
A proteína Flr1 é um transportador da família MFS-MDR. Assim, a observação da fluorescência da proteína de fusão Flr1::GFP na periferia celular de células contendo o plasmídeo pMET25_FLR1::GFP, aponta para uma localização da proteína Flr1 na membrana plasmática, como se pode observar na Figura 2 (Broco N, Resultados não publicados).
Esta técnica tem sido usada correntemente no nosso laboratório para proceder à localização subcelular de outras proteínas MFS-MDR, nomeadamente AZR1, AQR1, QDR1 e QDR2 (Tenreiro et al., 2000, 2002; Nunes et al., 2001; Vargas et al., 2004).
A eficiência desta técnica para proceder à localização subcelular de proteínas, levou inclusive à sua aplicação em larga escala, ou seja para localizar um elevado número de proteínas de levedura (Huh et al., 2003), resultados esses disponíveis na base de dados, a Yeast GFP Fusion Localization Database.
As fusões GFP têm sido também utilizadas para acompanhar o tráfego intracelular de proteínas em levedura, in vivo (ver Molecular Motion Movies). É o caso da deslocação do factor de transcrição Yap1 do citoplasma para o vacúolo, em condições de stresse oxidativo (Kuge et al., 1997). Outro exemplo é a utilização destas fusões para acompanhar proteínas da membrana plasmática desde a sua síntese, localização na membrana plasmática, até à sua degradação, permitindo identificar as vias de exocitose e de endocitose envolvidas (Paiva et al., 2002; Kelm et al., 2004).
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