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AUTORES: Sandra Tenreiro1 e Isabel Sá-Correia1,2
1GRUPO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DO CENTRO DE ENGENHARIA BIOLÓGICA E QUÍMICA, 2DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA, IST.
Estas páginas do portal têm por objectivo explorar o uso da base de dados da levedura Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces Genome Database, SGD) com vista a planear e/ou interpretar experiências de Biologia Molecular com o recurso a ferramentas computacionais apropriadas. O problema biológico seleccionado para o efeito, centra-se na análise funcional do gene FLR1 de Saccharomyces cerevisiae (ORF YBR008c). Este gene foi denominado com base na sua capacidade de conferir resistência ao importante fungicida de uso clínico fluconazole. Trata-se de um gene que codifica uma proteína que é um transportador de solutos, presente na membrana plasmática da levedura, como experimentalmente demonstrado com base na construção de uma fusão com a proteína fluorescente GFP (saber mais).
A proteína Flr1 pertence a uma família de transportadores de múltiplas drogas (MDR – Multidrug resistance) da Superfamília dos transportadores maioritários (MFS – Major Facilitator Superfamily) (saber mais). Estes transportadores conferem resistência a um grupo de drogas (ou outros compostos químicos tóxicos para a célula) estruturalmente e funcionalmente não relacionados, dando origem ao importantíssimo fenómeno biológico conhecido por resistência a múltiplas drogas (MDR – Multidrug resistance) (saber mais). São transportadores secundários que, quando presentes na membrana plasmática, expulsam activamente os compostos tóxicos para fora da célula, contra o gradiente de concentração. A força motora necessária para esse processo assenta no gradiente electroquímico transmembranar de protões, cuja manutenção depende da actividade de uma bomba de protões, a H+-ATPase que se encontra também presente na membrana plasmática (Serrano et al. 1986) (saber mais). Assim, explicar-se-á como é possível executar uma experiência que leve à eliminação deste gene (não essencial) do genoma de S. cerevisiae por recurso a uma cassete de eliminação cuja construção pressupõe a selecção de material biológico com base em ferramentas de bioinformática (saber mais) e a informação na SGD. Esse mutante Dflr1 pode depois ser usado para esclarecer a função biológica do gene eliminado, neste caso através da comparação da susceptibilidade a diversas drogas a testar, do mutante de eliminação por comparação com a estirpe selvagem de que foi derivado (saber mais).
Mostrar-se-ão resultados que indicam que o gene FLR1 confere resistência a benomil, um fungicida de interesse agrícola.
Explicar-se-á também como é possível elucidar aspectos de regulação de expressão deste gene por recurso a fusões-lacZ cuja construção será explicada (saber mais). Com base no uso da fusão lacZ construída, explicar-se-á como foi possível verificar que, durante a fase de adaptação da levedura a este fungicida, a expressão deste gene é activada brutalmente e que esta activação é integralmente dependente da presença do factor de transcrição Yap1 (saber mais).
Recomenda-se a visita a “ Análise da região promotora FLR1 ” onde se mostrará que na região promotora do gene FLR1 existem sequências consenso de ligação à proteína Yap1 o que, mesmo antes da comprovação experimental do papel do Yap1 na expressão do gene FLR1, permite atribuir ao Yap1, como hipótese de trabalho, um possível papel biológico na regulação do FLR1.
Por fim, espera-se que esta abordagem integrada de análise computacional e experimental, com base em técnicas de biologia molecular e de engenharia genética e na exploração do genoma de Saccharomyces cerevisiae, o primeiro organismo eucariótico com o genoma sequenciado (Goffeau et al., 1996; Oliver, 1997) permita compreender as potencialidades da Genómica Funcional e de Bioinformática na investigação em Biologia Molecular.
Introdução de conteúdos : Joana Camilo e Nuno Mira
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