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A adaptação fisiológica das células de S. cerevisiae durante a fase de latência induzida por um composto inibidor do crescimento, como é o caso do fungicida benomil, é extremamente importante para que a recuperação da viabilidade celular seja bem sucedida.
Para estudar a expressão do gene FLR1 nas células de levedura, durante a fase de latência e ao longo do crescimento na presença deste antifúngico, recorreu-se a duas abordagens complementares que foram a) o uso de uma fusão genética entre o promotor do gene FLR1 e o gene repórter lacZ, construída para o efeito (saber mais) e b) a técnica de hibridação de Northern.
Os resultados obtidos permitiram concluir que há um grande aumento da expressão do gene FLR1 precisamente durante a fase de latência (Figuras 1 e 2). Estes resultados reforçam a ideia da importância do gene FLR1 como determinante de resistência a benomil e sugerem que a regulação deste gene ocorra ao nível transcricional (Tenreiro et al., 2001).
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| Fig. 1 – Determinação da actividade de b-galactosidase em células de S. cerevisiae contendo a fusão FLR1-lacZ, ao longo da adaptação ao crescimento na presença de 1,5 mg/L de benomil (círculos fechados) ou em meio sem o fungicida (quadrados fechados). |
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| Fig. 2 – Hibridação de Northern, usando como sonda os genes FLR1 e ACT1, em RNA total extraído de células de S. cerevisiae crescidas na presença de 2,5 mg/ml de benomil. As setas indicam os pontos da curva de crescimento onde foram recolhidas as amostras usadas para a comparação dos níveis de mRNA. Os valores relativos de mRNA FLR1/mRNA ACT1 apresentados foram quantificados por densitometria das autorradiografias de duas experiências de Northern independentes. |
O que se procurou saber a seguir foi qual ou quais os factores de transcrição envolvidos na forte activação da expressão do gene FLR1 durante a fase de latência causada pelo benomil. Começou-se por fazer a análise do promotor do gene FLR1 recorrendo a ferramentas de bioinformática, nomeadamente ferramenta Regulatory Sequence Analysis Tools (RSAT), disponível na web. Essa análise permitiu identificar a existência, entre outras, de três sequências consenso YRE de ligação ao factor de transcrição Yap1, e uma sequência PDRE de ligação ao factor de transcrição Pdr3, (saber como).
Os factores de transcrição Yap1 e Pdr3 são conhecidos por estarem envolvidos na resposta celular a diversos tipos de stresse, em particular ao stresse oxidativo (Fernandes et al., 1997), e no stresse causado por drogas, respectivamente (Delaveau et al., 1994).
Para averiguar o papel destes factores de transcrição foi-se analisar o que acontecia à expressão do gene FLR1, em células expostas a benomil mas em que os genes YAP1 e PDR3 foram eliminados (por um processo análogo ao descrito para a eliminação do gene FLR1, neste portal, (ver aqui). Os resultados obtidos permitiram concluir que o factor de transcrição Yap1 é responsável pela activação da expressão do gene FLR1 em células expostas a benomil (Fig. 3) visto que a sua eliminação leva ao desaparecimento completo da referida activação (Tenreiro et al., 2001).
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| Fig. 3 – Hibridação de Northern usando como sondas os genes FLR1 ou ACT1, em RNA total extraído de células de S. cerevisiae contendo o gene YAP1 (selvagem) ou em que este foi eliminado (Dflr1), após 0 e 3 horas de exposição a 2,5 mg/ml de benomil. |
A eliminação do gene PDR3 também leva à redução da activação da expressão do gene FLR1 em 35-40% (Fig. 4), indicando que este factor de transcrição tem também um papel na activação observada (Tenreiro et al., 2001).
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Fig. 4 – Hibridação de Northern usando como sondas os genes FLR1 ou ACT1, em RNA total extraído de células de S. cerevisiae contendo o gene PDR3 (selvagem) ou em que este foi eliminado ((Dpdr3), após 1 horas de exposição a 2,5 mg/ml de benomil. Os valores relativos de mRNA FLR1/mRNA ACT1 apresentados foram quantificados por densitometria das autorradiografias de duas experiências de Northern independentes.
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No entanto, muitos mais factores de transcrição podem estar a actuar no promotor do gene FLR1, nestas condições (na presença de benomil) ou noutras condições de crescimento, como se sabe que acontece em geral nos promotores dos genes. Os indícios que apontam nesse sentido são a existência de outras sequências consenso, além das mencionadas acima no promotor do gene FLR1. São exemplos a sequência STRE (CCCCT) de ligação aos factores de transcrição Msn2/4 (Martinez-Pastor et al., 1996) e PDS (TAGGGAT) de ligação ao factor de transcrição Gis1 (Pedruzzi et al., 2000). Estas sequências podem ser encontradas no promotor do gene FLR1, recorrendo à ferramenta (RSAT), tal com foi realizado para as sequências PDRE e YRE (saber como).
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