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O método utilizado para proceder à extracção de DNA total de levedura consiste na quebra das paredes celulares com esferas de vidro, a que se segue a extracção do DNA pela forma clássica e pode ser utilizado com duas finalidades diferentes: extracção do DNA genómico de levedura, para posterior utilização em reacções de PCR, e extracção do DNA total, ou seja genómico e plasmídico, tendo em vista a recuperação posterior do DNA plasmídico em E. coli.
Ressuspendem-se 2 hansas de células em 200 ml de H2O, adicionam-se esferas de vidro (0,4 mm, BDH; um volume equivalente a 400 ml), e 300 ml de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico, agita-se 2 min. Centrifuga-se 5 min a 14000 rpm. Recupera-se o sobrenadante para novo tubo de 1,5 ml. Faz-se nova extracção fenol seguida de extracção éter. Recupera-se a fase inferior. Segue-se a precipitação do DNA com etanol 100% (2,5Í o volume) e coloca-se a -20°C, 15 min. Centrifuga-se 15 min de forma a separar o DNA precipitado e lava-se com 500 ml etanol 70°C (v/v). Centrifuga-se de novo 5 min. Despreza-se o sobrenadante e seca-se o DNA precipitado 5 min sobre vácuo. Ressuspende-se o DNA em 100 ml água estéril.
Se a finalidade do DNA total obtido for servir de molde numa reacção de PCR, usam-se 1 ml de DNA para proceder à reacção de PCR. Por outro lado, se a finalidade for a recuperação do DNA plasmídico, usam-se 10 ml de DNA e procede-se à electroporação de E. coli. O uso de uma tão elevada quantidade de DNA e a escolha da técnica de electroporação visa aumentar o rendimento da recuperação dos plasmídeos.
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