|
A preparação de amostras proteicas para serem separadas por electroforese 2-D é um dos passos que podem influenciar, de forma determinante, os resultados finais. Para se conseguir uma mistura proteica compatível com a electroforese 2-D, é aconselhável lavar duas ou três vezes o material biológico de partida (por exemplo células microbianas) com água desionizada fria ou com um tampão com baixa força iónica (ex. 10 mM Tris-HCl; pH 7.5, 250 mM sacarose). De facto, caso a amostra contenha muitos iões (força iónica elevada) muito dificilmente será bem separada por focagem isoeléctrica sendo por isso necessário remover esses iões, ou por precipitação das proteínas (Fig. 5) ou por diálise. Uma vez lavadas as células, o seu conteúdo proteico é extraído, podendo ser utilizadas diferentes metodologias de ruptura celular: por ultra-sons, por “French Press”, por agitação da suspensão celular, em vórtex, com esferas de vidro. A escolha do método depende, entre outros factores, do modelo biológico em estudo. O extracto bruto obtido geralmente contém, para além das proteínas, outros componentes celulares tais como lípidos, hidratos de carbono e ácidos nucleicos. Para eliminar ou reduzir a quantidade destes contaminantes poder-se-á precipitar, selectivamente, as proteínas presentes nos extractos brutos, usando, por exemplo, ácido tricloroacético e/ou acetona ou ainda recorrendo a kits comerciais (ex. 2-D Clean Up kit, desenvolvido pela Amersham Biosciences).
| 
| Fig. 4 - Representação esquemática dos passos da preparação da amostra para electroforese bi-dimensional.
|
Para se proceder à focagem isoeléctrica (1ª dimensão), as amostras proteicas deverão ser previamente solubilizadas numa solução desnaturante, não iónica, que permita a separação das proteínas conforme o seu pI. Normalmente, estas soluções são compostas por ureia (para desnaturar as proteínas), um agente redutor (para evitar oxidação das proteínas), um detergente não iónico ou zwitteriónico (para solubilizar as proteínas) e anfólitos (para facilitar a focagem isoeléctrica). Uma das formulações mais comuns é constituída por: 9 M ureia (a concentração da ureia deve ser sempre igual ou superior a 8 M), 15 mM DTT, 2% CHAPS (ou Triton X100), 0.5% anfólitos (disponíveis comercialmente) e uns pós de azul de bromofenol. No entanto, para certas aplicações específicas, poderá ser possível obter melhores resultados usando outras formulações. Por exemplo, se o objectivo do trabalho for o de estudar a abundância relativa das proteínas membranares em diferentes condições fisiológicas, poder-se-á optar pela utilização de detergentes mais eficazes na solubilização desse género de proteínas como, por exemplo, o DM (n-dodecy-b-D-maltoside, Alexis), SB3-10 (sulfobetain-10, Amresco) ou ASB14 (amidosulfobetaine-14, Calbiochem) (Fig. 6).
|
