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Com vista à obtenção de mutantes de B. cepacia não produtores de exopolissacárido utilizou-se a denominada mutagénese por recurso a transposões. Neste caso particular, usou-se o TnMod-OKm (Fig. 3). Este transposão está contido num plasmídeo de gama estreita de hospedeiros capaz de replicar somente em Escherichia coli. Possui as regiões denominadas “inverted repeats” do transposão Tn5 e entre elas encontra-se, para além da origem de replicação oriR proveniente do plasmídeo pMB1, o gene que codifica uma proteína com actividade de aminoglucósido fosfotransferase e que confere resitência à canamicina. Fora desta região, encontra-se a origem de transferência (oriT) do plasmídeo conjugativo RP4 e o gene que codifica para a transposase do Tn5 (Fig. 3). Pelo facto de a sequência contida entre as inverted repeats conter uma origem de replicação, este transposão denomina-se plasposão.
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| Fig. 3 Mapa físico do plasposão pTnMod-Okm (Dennis and Zylstra, 1998) . Encontram-se representadas apenas algumas das endonucleases que apresentam locais de reconhecimento |
A estratégia para a obtenção de mutantes de B. cepacia não produtores de cepaciano encontra-se representada na Fig. 4. Mobilizou-se, através do processo de conjugação triparental, o plasposão pTnMod-Okm de E. coli para a estirpe produtora de exopolissacárido B. cepacia IST408. Os transconjugantes foram seleccionados em meio S suplementado com canamicina e as colónias com aparência menos mucosa foram repicadas para novas placas.
Para determinar quais das colónias perderam efectivamente a capacidade de produzir exopolissacárido, foi efectuada uma coloração com o corante lipofílico negro de sudão. As colónias que não incorporaram o corante foram seleccionadas e confirmada a ausência de exopolissacárido em meio S. Na Fig. 4, podem observar-se duas placas de Petri, uma delas com colónias da estirpe produtora B. cepacia IST408, com aspecto altamente mucoso, e a outra de um seu mutante isogénico, não produtor de exopolissacárido, obtido numa experiência idêntica à anteriormente descrita.
Através desta estratégia, foi possível obter seis mutantes não produtores de cepaciano, denominados IST408-SS1, IST408-SS2, IST408-SS3, IST408-SS4, IST408-SS5 e IST408-SS6.
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| Fig. 4 Representação das várias etapas efectuadas para a obtenção de mutantes de B. cepacia deficientes na produção do exopolissacárido cepaciano. A estirpe E. coli JM109 contém o plasmídeo pTnMod-KmO não replicativo em B. cepacia e com o plasposão inserido. A estirpe de E. coli HB101 contém o plasmídeo pRK3013 ajudante no processo de conjugação. As colónias não mucosas seleccionadas contêm presumivelmente o plasposão inserido em genes para a biossíntese de EPS.
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